W 1503 roku artysta został zatrudniony przez miasto. Władze Florencji zamówiły u niego wielki fresk, przedstawiający zwycięską bitwę pod Anghiari. Leonardo ozdobił jedną ze ścian tzw. Sali Pięciuset w Palazzo Vecchio, ale pracy nie dokończył, prawdopodobnie z powodu problemów z eksperymentalną techniką malarską. Istnieją kopie fresku, m.in. rysunek Rubensa znajdujący się w Luwrze.
Długo uważano, że dzieło mistrza renesansu zostało zniszczone, bo w połowie XVI wieku pałac został przebudowany, a ściany sali Pięciuset ozdobił nowy fresk Giorgio Vasariego.
Przed rokiem włoscy naukowcy rozpoczęli badania pod kierunkiem Maurizio Seraciniego, pracującego na University of California. Wywiercili sześć małych otworów we fresku "Bitwa pod Marciano" Giorgio Vasariego z 1563 roku i używając sond z kamerami pobrali próbki pigmentu z wcześniejszego malowidła. Po kolejnych badaniach przy użyciu elektronowego mikroskopu stwierdzili, że czarny pigment jest taki sam, jakiego używał Lenardo da Vinci, malując Monę Lizę i św. Jana Baptystę,
Na konferencji zwołanej w tym tygodniu we Florencji Seracini ogłosił: - Leonardo malował Monę Lizę we Florencji w tym samym czasie. Czarnego pigmentu na fresku używał on sam, żaden inny artysta.
Pobrane również płatki czerwonego materiału - według oceny zespołu naukowców - to prawdopodobnie lakier. - Wątpliwe, żeby pochodził ze zwykłego tynku ściany - twierdzą.
